肝脏代谢组学的综合分析对于疾病生物标志物的发现和肝脏相关疾病研究意义重大，但肝组织中存在的血液可能会对肝组织代谢组学分析产生重大影响，因此，我们在做肝脏样本的代谢组学的研究的时候，是否需要对肝脏进行灌注？浙江大学医学院李兰娟院士团队与加拿大阿尔伯塔大学厉良院士团队合作，采用高效化学同位素标记(HP-CIL)代谢组学技术试图解决这一难题。
发表时间：2021.02
本文通过高效化学同位素标记(CIL)液相色谱-质谱联用技术共分析了82例小鼠的样本，分别来自于32例未灌注肝脏、36例灌注肝脏和14例血清样本；实验分为3个阶段，第一阶段：探索灌注肝脏与未灌注肝脏样本之间的代谢变化，共24例样本（分别来自12个未灌注肝脏与12个灌注肝脏）；第二阶段：不同灌注温度的肝脏代谢变化，共16例肝脏样本（分别来自5个低温灌注肝脏、5个室温灌注肝脏以及6个未灌注肝脏）；第三阶段：血清、未灌注和灌注肝脏代谢变化，共42例样本（分别来自 14 个未灌注肝脏、14 个灌注肝脏和 14 个血清样本）。图1为本研究关于血清和肝脏的CIL LC-MS代谢组学的工作流程。
图1 血清和肝脏的CIL-LC/MS的工作流程图
1.未灌注和灌注的肝脏的代谢组学
由于肝脏含有组织和血液，因此分析一个未经血液清除的肝脏样品会造成组织和血液代谢产物的混合。为考察组织和血液代谢产物在肝脏代谢产物中的贡献情况，本文对未灌注肝脏( C-L )、灌注肝脏( CP-L1 )以及分别添加不同量血液的灌注肝脏 (CP-L2至 CP-L5 )进行代谢代谢组学分析。
图2A表明：在0 %、5 %、10 %、15 %和20 %血液灌注肝脏中分别检测到1969、1852、1879、1867和1874个峰对。其中，在5组样本中发现1669共有峰对( 78.3 % )。图2B的Venn图显示：C-L与Cp-Lx ( x = 1至 5 )的二元比较中发现8种共有代谢物。图3清晰明了地展示6组数据中组内的重复性和组间的差异性良好，以及6个肝组的共有峰对为1634个。本文以CP-L1为基础，对6个肝组进行代谢的二元比较，便于明确血液对肝脏代谢的影响。图4表明在C-L与Cp-Lx ( x = 1至 5 )的二元比较中，显著代谢物的数量分别为160、26、33、36和60。
上述结果表明，从非灌注样本( C-L )到灌注样本( CP-L1 )的代谢组学数据有较大的变化，而随着血液量的增加，灌注样本的代谢数据变化更为平缓。推测灌注步骤可能会造成组织代谢物的变化，而新鲜收获的肝脏可能保留代谢酶活性。
图3 有QC样本的(A)和无QC样本的(B)对照小鼠的6种肝脏样本的PCA图
图4 火山图（非灌注肝脏与灌注肝脏或添加5%-20%血液的灌注肝脏二元比较）
2.灌注温度对肝脏代谢组学的影响
在L、L-L、L-R组中，分别检测到1523、1545和1524个峰对。其中图5的PCA图与OPLS-DA图显示三组样本的分离情况，说明实验设计与样本分组合理。我们对三组样本进行了二元比较，L vs. L-R, L vs. L-L, and L-L vs. L-R比较时，当FC > 2，FDR-p < 0.05的显著代谢物数为71、20和3；而 FC > 1.5，显著代谢物数为296、 151、 96 （图6）。上述结果表明，未灌注肝脏与低温灌注肝脏的代谢物差值小于常温灌注肝脏的代谢物差值。在低温灌注过程中，酶活性降低，导致低温灌注肝脏和非灌注肝脏之间发生显著变化的代谢物数量较少。这些发现支持了灌注改变组织代谢组的推测。
图 5 三种肝脏样本和无QC样本的(B)肝脏样本的PCA图
图6 火山图（用于对非灌注肝脏与冰冷灌注肝脏或室温灌注肝脏的二元比较，以及冰冷灌注肝脏与室温灌注肝脏的二元比较）
3.化学暴露模型下的小鼠代谢
在本研究中，采用小鼠化学暴露模型的血清、非灌注肝脏和灌注肝脏样本来检测代谢的变化。暴露于四氯化碳( CCl4 )引起肝损伤的小鼠已被广泛用于疾病和功能的研究，其中ALT和AST是肝功能的生物标志物。与对照组相比，CCl4组ALT和AST显著升高( p < 0.001 )。再者，通过病理H & E染色能够证实肝损伤模型，其中正常小鼠肝组织切片显示肝细胞明显，胞浆保存良好，细胞核突出，肝细胞呈放射状排列于中央静脉周围，而CCl4处理的小鼠肝切片表现为严重的胞浆空泡化，肝细胞空泡变性，细胞界限和细胞核丧失，中央静脉周围及门静脉区炎性细胞浸润。
对于肝脏代谢组，同组样品检测到2459个共有峰对，其中基于精确分子量和保留时间匹配的衍生化标准品数据库，鉴定223个代谢物(层级1)，基于精确分子量和保留时间匹配关联代谢物数据，鉴定107个代谢物(层级2)。此外，通过精确分子量，对MCID数据库对代谢物进行匹配，分别在0级反应库、1级反应库、2级反应库中匹配446、1440，1743个代谢物（层级3）。因此，在2459个峰对中，共有2073个（84.3%）可以被准确鉴定或推定。对于血清代谢组，共检测到1195个峰对。其中，层级1和层级2分别鉴定出135种和56种代谢物。层级3中0、1和2反应库分别有241、663和831个代谢物。
图7显示在血清（C-S或D-S）、非灌注肝脏（C-L或D-L）和灌注肝脏样本（CP-L或DP-L）3类样本中检测到峰对的分布情况。在对照组中，C-L和CP-L共检测2128对，C-L和D-L共检测1926对，C-S与D-S共检测1120对。此外，C-L和CP-L中可检测到775（69.2%）和761（67.9%），其中3类样本检测到共检测726对（64.8%）。在CCl4 组，D-L和DP-L共发现2139对，D-L和DP-L共检测1918对，C-S或D-S共检测1156对峰对，此外D-L和DP-L分别检测到821对（71%）和813对（70.3%），3类样本检测到共检测773对（66.9%）。
上述结果表明，两种肝脏样本检测到的峰对数量相似，在血清和灌注肝脏中通常检测到的峰对数量与在血清和非灌注肝脏中通常检测到的峰对数量接近。因此，就检测到的代谢物数量而言，血液代谢物对肝脏组织代谢的贡献并不显著。这一观察结果与添加不同血液量灌注样本的比较结果一致：非灌注肝脏代谢物数量并不是灌注肝脏代谢组和血液代谢组的简单总和。
5.健康和肝损伤小鼠的代谢物差异
由图8、图9可以看出，对照组与疾病组之间存在明显存在显著变化的代谢产物。此外在灌注肝脏与非灌注肝脏条件下，对照组和疾病组之间显著变化的代谢物有所增加：如图 10A 表明，FC > 2条件下，在肝脏和血清中仅有6种差异代谢物，而在肝脏和血清中分别有97和134种差异代谢物是唯一的。图 10B显示，FC > 1.5条件下，血清与肝脏样本间差异代谢物存在重叠情况( 分别为19 3和 7 3种代谢物 )，同样也检测到更多特有的在肝脏( 112 )或血清( 256 )重要代谢产物。因此，血清和肝脏中变化的代谢产物有很大差异。由此可见，这些代谢物增加的数量极有可能是疾病和灌注共同引起的结果。肝脏灌注可以干扰化学暴露引起的代谢组变化的检测，但血液对肝脏代谢组学分析的干扰程度较小。
图9 对照组小鼠与肝损伤小鼠的二元比较的火山图：C-L vs D-L(A)，CP-L vs DP-L(B)，和C-S vs D-S(C).
图10 从C-L vs D - L、Cp - L vs Dp-L、C-S vs D-s 的比较中检测到的重要代谢物数量的Venn图。Vip > 1.5，FC > 2，FDR-p<0.05(A ); Vip > 1.5，FC >1.5，FDR-p<0.05(B )
本文利用HP-CIL代谢组学技术研究了血液对肝脏代谢组学分析的影响。尽管选择低温灌注，但依旧会引起肝脏代谢物的显著变化。此外，分析来自肝损伤小鼠的血清和肝脏，发现血清或肝脏样品中大部分显著变化的代谢产物是独特的。血液对非灌注肝脏代谢组学分析的干扰相对较小，因此推荐使用未灌注的肝脏来进行肝脏的代谢组学研究。
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