期刊：Movement Disorders
发表时间：2017.12
影响因子：10.338
帕金森（parkinsondisease，PD）是一种常见于中老年的神经系统变性疾病，也是中老年人最常见的锥体外系疾病。65岁以上人群患病率为1700/10万，随年龄增高，男性稍多于女性。本病主要病理改变为黑质多巴胺能神经元变性死亡，但具体引起的病因及发病机制还未完全明确，有研究认为其可能与遗传、环境、神经系统老化等因素有关。加拿大皇家科学院院士阿尔伯塔大学厉良教授采用高效化学同位素标记（High Performance-Chemical Isotope labeling，HP-CIL）代谢组学技术，收集健康人群与PD患者的血清样本，进行全面代谢组学分析，探索与帕金森疾病相关的潜在生物标志物。
本文通过HP-CIL代谢组学技术共检测85例样本，分别来自42名健康人群和43名PD患者的血清样本，PD组包括无痴呆PD（PDND 亚组）和早期痴呆组（ PDID 亚组）。基线样本经历共3轮的纵向研究，其中16例PD患者在基线时被归类为PD伴早期痴呆，在第三年发现其被诊断为痴呆。
1.代谢物鉴定
应用三层级代谢物数据库对代谢物进行鉴定，共检测到719种代谢物，共准确鉴定或推定681种（95%）代谢物。三层级数据库鉴定方法如下：第一层级：根据精确分子量和保留时间，匹配丹磺酰化标准品数据库（CIL Library）66种代谢物。第二层级：应用关联代谢物数据库（LI Library）对剩余代谢物进行鉴定，根据精确分子量和预测保留时间匹配可信度极高的333个代谢物，第三层级：使用据精确分子量，在MyCompoundID (MCID)数据库识别到282个代谢物。
2.代谢组分析发现的PD生物标志物
图1表明，健康对照组和帕金森病患者的血清代谢轮廓之间存在显著差异（图1A、1B），进一步的验证(图1C)进一步说明分组的准确可靠，从火山图（1D）中可以得出共有28种差异代谢物上调（红色），48种差异代谢物下调（蓝色）。仅在PD组中观察到四种重要的代谢物，即4-羟基苯丙二酸、香草扁桃酸异构体、α-甲基多巴和甲基鸟嘌呤。
图1 健康人群（绿色）和PD患者血清代谢组学的(A)PLS-DA评分图；(B)OPLS-DA评分图；(C)PLS-DA模型的响应排列检验结果；(D)健康对照和PD组之间的比较火山图
3.无痴呆的PD与患有早期痴呆的PD患者之间的代谢组学分析
图2表明，无痴呆的PD患者(PDND 亚组，红色)和16例患有早期痴呆的PD患者(PDID 亚组，蓝色)之间存在显著差异（图2A、2B），进一步的验证(图2C)说明分组的准确可靠，从火山图（2D）中可以得出共有21种差异代谢物上调（红色），15种差异代谢物下调（蓝色）。
图2 无痴呆的PD患者(红色)和患有早期痴呆的PD患者(蓝色)血清代谢组学的(A)PLS-DA评分图；(B)OPLS-DA评分图；(C)PLS-DA模型的响应排列检验结果；(D)PDND亚组和PDID亚组之间的比较火山图
4.生物标志物组的ROC曲线
对比上述获得的差异代谢物，可以发现有5种共同的显著代谢物。基于香草酸、3-羟基金尿氨酸、异亮氨基丙氨酸、5-乙酰氨基-6-氨基-3-甲基尿嘧啶、茶碱等5种代谢物，采用随机森林法建立分类模型。各代谢物的曲线下面积(AUC)值分别分别为0.939、0.781、0.794、0.730和0.714。通过将这5种代谢物结合到一个生物标志物panel中，提高了鉴别能力。图3A所示的相应ROC曲线产生的AUC值为0.955，在95%置信区间的0.896-0.990范围内。PD与对照组的区分敏感性为87.5%，特异性为92.0%。
为了能在基线时区分无痴呆的PD患者和早期痴呆的PD患者，我们选择了以下8个具有高度独立AUC的生物标记物组成一个panel：His-Asn-Asp- Ser (AUC=0.597)、3，4-二羟基苯丙酮(0.677)、去氨基酪氨酸(0.640)，羟基-异亮氨酸(0.610)、丙氨酰-丙氨酸(0.737)、腐胺[-2H] (0.736)、嘌呤[ O] (0.627)及核糖苷(0.597)。如图 3B 所示，该生物标志物组的 ROC 曲线得出的 AUC 值为 0.862，在 95%置信区间内介于 0.757-0.955 之间。该panel可提供灵敏度为80.0%、特异性为 77.0%的鉴别能力。
图3 (A)随机森林模型生成的以下5种代谢物生物标志物：香草酸、3-羟基尿氨酸、异亮基-丙氨酸、5-乙酰氨基-6-氨基-3-甲基尿嘧啶和茶碱。(B)随机森林模型生成的受试者工作特征曲线，使用以下8种代谢物生物标志物：His-Asn-Asp-Ser、3、4-二羟基苯丙酮、去氨基酪氨酸、羟基异亮氨酸、丙酰丙氨酸、嘌呤[-2H]、嘌呤[ O]及核糖苷。
5.相关代谢途径分析
代谢途径分析表明，儿茶酚胺代谢、色氨酸代谢和咖啡因代谢是与 PD 关系最密切的代谢组学途径。PD 组与对照组比较，儿茶酚胺代谢倍数变化高达 3.80，提示存在明显的由 PD 而非药物所致的代谢变化。
儿茶酚胺代谢途径中：香草酸的衍生物香草酸[-CO]，也是 PD 组中的一种独特代谢产物。图4的箱形图显示了对照组、无痴呆的PD患者和早期痴呆的PD患者中这些代谢产物的相对浓度。尽管所有四种药物在 PD 患者血清中的浓度均升高，但 PDID 亚组的相对浓度高于 PDND 亚组。
色氨酸代谢途径中：尽管色氨酸和犬尿氨酸的浓度变化不大，但在 PD 组中观察到 3-羟基犬尿氨酸的相对浓度升高。图 5 显示了不同组中色氨酸、犬尿氨酸和 3-羟基犬尿氨酸的相对浓度。
咖啡因代谢途径中，PD 组中咖啡因代谢产物的浓度较低。黄嘌呤也可以通过嘌呤途径由次黄嘌呤和鸟嘌呤转化而来，其浓度变化不大。图 6显示了不同组中茶碱、5-乙酰氨基-6-氨基-3-甲基尿嘧啶和黄嘌呤的相对浓度。
氧化应激途径中，蛋氨酸亚砜是蛋氨酸与活性氧的氧化产物，被认为是氧化应激的生物标志物。根据我们的结果，蛋氨酸亚砜及其异构体在 PD 组中的浓度增加。
图4 对照组、无痴呆的PD患者(A)香草酸、(B)香草酸异构体、(C)香草酸和(D)香草酸的相对浓度的箱形图
图5 对照组、无痴呆PD患者和早期痴呆PD患者(A)色氨酸、(B)金蛋白和(C)3-羟基金蛋白相对浓度的箱形图
图6（A）咖啡因代谢途径的简化示意图。对照组、(B)无痴呆的PD患者和早期痴呆的PD患者的茶碱、(C)5-6-氨基-氨基-3-甲基尿嘧啶和(D)黄嘌呤相对浓度的箱形图
本文利用HP-CIL LC-MS对健康人群与PD患者（包括无痴呆PD和早期痴呆组）的血清进行深度代谢组学分析，并通过进一步的统计学分析发现能够准确区分各类人群的潜在生物标志物。本研究为PD 神经病理学潜在途径提供指导意见，为早期辨别痴呆风险相关代谢途径的研究提供新的思路。
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