迈理奥小讲堂 | 临床代谢组学研究中的不足与挑战

代谢组学可以更全面地了解疾病的病理生理条件和发生发展机制，并作为精准诊断和预后的工具，已成为现代临床研究的重要组成部分。代谢组学被认为是精准医疗的重要手段，然而，在研究的整个工作流程中，也面临着众多的不足与挑战。

代谢组学研究的预期结果很大程度上受实验设计的影响，不适当的研究设计可能会造成误导性的统计结果，进而导致不准确的生物学解释。病例对照研究是常见的代谢组学研究方向，旨在发现代谢组、临床因素和特定疾病或健康状况之间的显著关联。在研究设计中，病例组和对照组之间的潜在混杂因素应尽可能相似，但完全了解和调控所有因素是相当困难的，获得有意义的高置信度研究受试者的数量也难以估计。因此，在特定范围内选择受试者、根据试点研究或经验估计受试者招募数量、设置足够数量的生物学重复等措施可一定程度上改善实验设计上的不足。

各种生物类型样本都可以进行代谢组学分析，但样品污染、降解或低分析物回收率会对分析结果产生重要影响，同时标准化的样品获取条件对分析结果的可信度与可重复性也有重要影响。绝大多数的人类代谢组学研究主要是对尿液或血液样本的分析。对于血液样本，昼夜节律振荡、动静脉血的成分区别、收集时抗凝剂的使用情况等均会影响血清或血浆样本的代谢组分析，因此，需要对采血时间、部位、保存条件等设置相同标准。对于尿液样本，尿液的组成受环境因素影响的波动比血液更大，易受细菌污染，且存在显著的浓度差异，需要进行额外的归一化处理。因此，选择相近的收集时间、尿液段、相同的储存容器和统一规范的收集，可以确保在整个样本收集和处理的过程中具有最高的可重复性。

由于化学反应和酶降解的存在，样品储存条件对代谢物的定性和定量有很大的影响。许多类型的化合物可能会受到样本收集处理和储存不当的影响，尤其是能量代谢物。由于样品的收集和分析间隔难以预计，因此必须监测多个参数，以降低代谢物降解和相互转化的风险，尽可能保持温度、光照、湿度恒定，时间跨度短，处理、猝灭过程迅速，并减少冻融循环次数等。最佳样品制备程序的选择依赖于分析物的基质、感兴趣化合物的理化性质、样品的体积和检测平台等。分批次规范预处理大规模研究样品、自动化工作站的普及可显著减少由于操作员操作不当而引入的样品污染或低实验重复性等分析误差和批次效应，使用非选择性样品预处理方法可获得更广泛的非靶向代谢组学代谢物覆盖率，有针对性的添加内标以减少化合物降解的潜在风险。

在不可靠的实验条件下，分析变异性将显著影响总体之间的有效比较，尤其是非靶向代谢组学方法。为了确保所有批次间的可重复性和再现性，分析工作流程应包括样品的事先随机化、重复进样空白样品以及在整个分析批次中多次进样质控样本(QC)，并通过例行维护设备保持色谱和质谱仪的性能。随机化降低了偏倚风险，并确保代谢物水平与分析顺序之间不引入相关性；在样品分析之前进样空白样品，以稳定系统和监测潜在的污染物；QC有多种作用，包括平衡分析平台、在开始测序前控制信号强度、估计批次间的中间精密度以及批次内或批间的信号校正和标准化。

代谢物的分离步骤通常在质谱(MS)检测之前使用色谱或电泳技术(CE)进行，所有技术都具有特定的优点和局限性。气相色谱(GC)是代谢组学中最早应用的分离技术，主要由蒸发温度的差异驱动分离。由于没有涡旋扩散，它的分离效率显著优于液相色谱(LC)，但同时存在3个主要局限性：第一，可能失去耐热分析物；第二，样品制备步骤繁琐，特别是需要对分析物进行衍生化；第三，与基于LC的代谢组学相比，通常具有更高的不稳定性。因此，获取可靠的GC-MS代谢组数据，可使用一致的内衬设计(即锥形、鹅颈或双鹅颈)，持续使用进气内衬和玻璃棉，定期维护时间表，进样系统适合性测试和质量控制，定期更换GC柱，以及使用最高质量的衍生化试剂和溶剂，严格控制衍生化过程并实现自动化。对于液相色谱(LC)，反相色谱(RPLC)仍为金标准，其在点喷雾离子源(ESI)正离子模式下具有良好的电离效率和保留时间重复性，但可能存在离子抑制和高极性成分的不良保留，缺乏商业上可用的谱库，内部建立的包含保留时间和谱图信息的数据库将为代谢物鉴定提供一个有价值的工具。使用亲水性色谱法(HILIC)进行的代谢组学研究在不断增加，洗脱溶剂的优化增加了MS信号，实现直接进样有机提取物的可能性，但存在保留时间的可变性较高、平衡时间较长、观察到的峰形状较差等缺点，需要更优异的分析工作流程以确保获得高质量的数据。毛细血管电泳(CE)与MS联用对于极性代谢化合物有较高的选择性和分离效率，适用于容量有限的样品和单细胞代谢组学分析。但其较低的整体灵敏度、较差的迁移时间重现性和进样重复性，较高的软硬件要求和专业知识要求限制了该技术在代谢组学中的应用。随着CE仪器的进一步发展，特别是具有稳定性和灵敏度更高的CE-MS界面，该技术将作为色谱技术之外的补充工具得到充分利用。

质谱(MS)已广泛应用于代谢组学研究，在色谱或电泳分离后仍作为金标准的检测技术。MS代谢组学主要采用的电离技术有以下4种：电子电离(EI)和化学电离(CI)通常与GC结合使用，EI的主要优点是其高度标准化和可重复性，但在低质荷比范围很难解释碎片光谱，可考虑使用较低的动能(≤70eV)减少碎片的产生；与EI相比，CI允许测定分子离子，但由于缺乏谱库，常与EI互通；电喷雾电离(ESI)与LC和CE结合使用，电离效率高，质量范围几乎不受限制，液体直接电离，是代谢组学领域应用最广泛的电离技术，但其可能抑制或增强基质效应影响结果解读；大气压化学电离(APCI)常与LC耦合，用于极性和中性化合物的电离，也可与GC、CE结合使用，但由于缺乏识别谱库至今鲜有报道。

根据研究目的不同，临床代谢组学中使用高分辨率质谱，如四极杆飞行时间(qToF)或Orbitrap分析仪，以及四极杆、离子阱和其他混合仪器。在靶向代谢组学研究中，主要是三重四极杆或采用了四极杆线性离子阱质量分析仪，当使用选择性反应监测(SRM)模式时，它们具有高灵敏度和选择性，但仍然不足以区分具有相同质量的几何异构体。因此，需要添加合适的手性选择器以更好地分离对映体，还可以考虑手性气相分离、核磁共振位移试剂、手性CE和衍生化试剂等新途径。在非靶向代谢组学中，qToF系统被使用率较高，因为它们提供高质量分辨率和准确性，以及高扫描速度。值得注意的是，获得的高分辨率光谱数据有利于化合物的鉴定，有利于数据库搜索和元素组成的生成。然而，根据最近的研究，对感兴趣的化合物的明确鉴别不应仅仅依靠高分辨率质谱，还应包括串联质谱测量，并与真实的合成标准物质的保留时间和MS(/MS)光谱进行理想的比较。

核磁共振（NMR）在临床代谢组学中是对质谱的补充，是一种无损技术，样本准备相对简单。虽然NMR已经成功与LC联用，但临床代谢组学研究通常涉及直接的核磁共振测量。与基于MS的技术相比，其灵敏度相对较低，使用强大的超导磁体和低温探针在低温下操作接收器电路才可以降低电子噪声、提高灵敏度。在尿液分析中，样品的pH值会影响某些峰的化学位移，在样品制备过程中加入磷酸盐缓冲液可以稳定pH，对齐算法可以补偿由于这些效应引起的峰移动。由于生物流体中溶剂、pH和盐浓度不同而影响准确的化学位移，其峰位置可能与标准溶液不同，这些都将给代谢物鉴定带来挑战。因此，除了标准的一维光谱外，通常还会为每个样品记录2D-J分辨光谱，将化学位移相互作用和J耦合的影响分离到两个不同的光谱维度，从而显著减少峰重叠，并使用统计总相关谱(STOCSY)的方法来分配峰值。

数据分析依赖于从原始数据到相关代谢物列表的几个步骤，包括数据预处理、数据预验证和多变量数据分析和统计分析。选择最优的数据预处理算法、对齐和拾峰参数，可以提高数据预处理步骤的准确性，再通过归一化步骤显著提高标准化程度。通过数据缩放、定中和转换，以将特征列表转换为适合数据分析本身的不同尺度，再进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)等多变量分析。在代谢组学数据分析中，无监督PCA方法在类内变异小于类间变异时产生类分离，应尽量避免样品准备问题、实验偏差或不充分的数据预处理导致的误导性类分离；有监督的方法在变量数量远远高于样本时往往过拟合数据，因此，还需要对模型进行内部交叉验证如排列检验确定其有效性。

代谢物鉴定后，候选生物标志物的选择会影响后续验证研究的结果，对数据赋予合理的生物学解释十分重要。只有将基因组学、蛋白质组学和转录组学等多组学数据结合，结合系统生物学和机制方法，才能揭示相关途径和生物分子机制。候选生物标志物的验证即确认临床效用是关键的最后一步，应根据其目的（预测、诊断或预后）来决定临床应用所需的敏感性和特异性。尽管通过代谢组学研究发现了许多潜在的生物标志物，但目前这些生物标志物还未被批准和真正应用到临床实践中。

基于代谢组学的策略在临床研究中显示出的相关性，为更好地理解病理生理过程、疾病机制提供创新工具，并为改进诊断、预后和发现新的治疗靶点提供新的策略。本文综述了从研究设计到数据分析等过程中的各个步骤，罗列了以NMR和MS为基础的临床代谢组学可能会遇到的不足和分析挑战，并提供了一些解决方案。

图1 临床代谢组学面临的不足与挑战，及可能的解决方案

Kohler I, Verhoeven A, Derks RJ, Giera M. Analytical pitfalls and challenges in clinical metabolomics. Bioanalysis. 2016 Jul; 8(14):1509-32. doi: 10.4155/bio-2016-0090. Epub 2016 Jun 21.

平台采用全球领先的高效化学同位素标记（HP-CIL）技术和国际前沿的LC-MS仪器设备，并通过全套优化的具有自主知识产权的IsoMS Pro软件进行数据分析；

颠覆式的技术创新突破了常规代谢组学方法的瓶颈，已应用于数百项研究，涉及疾病诊断、健康监测、药物研发、中医药研究、食品农业、环境监测等领域，成果显著，如阿尔茨海默症（加拿大脑计划）生物标志物的探索、乌帕替尼（艾伯维）的新适应症疗效评估、食品发酵过程监测等，体现了更高灵敏度、高覆盖率、高精准定量、高稳定性的全方位、多层面的领先优势。